Detección óptica in vivo sin contacto del movimiento de los cilios mediante el análisis de patrones de motas

Configuración experimental

La configuración óptica (Fig. 1a) incluye un láser proyectado a través de un endoscopio flexible (terapéutico PENTAX FNL-15RP3) que se usa para ver los cilios de la cavidad nasal del sujeto. Los endoscopios se utilizan comúnmente en procedimientos médicos en la clínica de otorrinolaringología (ENT) (según la sección “Antropometría”). El endoscopio tiene un canal de instrumentos de 2,1 mm de diámetro, un tubo de inserción de 4,9 mm de diámetro y un ángulo de visión de \ (75 ^ \ círculo \) (con 0.6 NA). Se insertaron fibras en el canal de trabajo del endoscopio y el extremo del endoscopio se dirigió hacia la cavidad nasal. El láser (FP-FCL-660-30MD-800-FC, Laser Components, Alemania), colimador de fibra óptica, tenía una longitud de onda de 650 nm, con una potencia de salida de 5mW. La longitud de onda de la fuente de láser fue de 650 nm, que tiene baja absorción en los tejidos humanos y permite el uso de una fuente de láser biocompatible débil con baja potencia. Para obtener un único punto de iluminación, se colocó una lente GRIN (GRIN2906, Thorlabs, EE. UU.) en el extremo de la fibra.

Configuración óptica para caracterizar el movimiento de los cilios. (a) La configuración consta de un endoscopio, un láser de fibra de 650 nm, un sistema de imágenes y un sistema de desenfoque para patrones de motas. (B) El sistema de imágenes y el sistema de desenfoque consisten en lentes y cámaras conectadas a una caja negra con un espejo dicromático de 650 nm.

La configuración consta de dos sistemas ópticos, ambos con lentes y cámaras conectadas a una computadora. Una es capturar el patrón de manchas y la segunda es visualizar el área de interés. Los sistemas se conectaron a una caja de plástico negra emparejada con la salida del endoscopio (sistema de imágenes y desenfoque en la Fig. 1a). La caja dividió la luz retrodispersada por un espejo dicroico de 650 nm en detección de puntos e imágenes visuales (para ubicar el haz en la región de los cilios) simultáneamente (Fig. 1b).

El sistema de desenfoque extrajo el movimiento de los cilios al correlacionar los patrones de puntos reflejos y analizar los cambios temporales en la ubicación del pico de unión. Los patrones de manchas se crearon iluminando la mucosa de la cavidad nasal. Para sentir las vibraciones de los cilios, la cámara (Basler acA800-510um) fue desenfocada en el área de campo lejano, conectada a una lente con una distancia focal de 70 mm. La lente produjo una imagen desenfocada de puntos en la matriz de detección de la cámara a 200 cuadros por segundo (fps). El segundo sistema de imágenes permitió al médico visualizar el sitio iluminado de la mucosa nasal. Este sistema consta de una lente de distancia focal de 25 mm que se adjunta a la cámara (Basler acA800-510uc). Además, el endoscopio se conectó a una fuente de luz blanca que le permitió al médico ver el video en nuestra computadora y determinar que el extremo del endoscopio estaba dirigido a la mucosa. La cámara capturó imágenes a 200 fotogramas por segundo, con un tamaño de píxel de 4,8 µm. Nuestro campo de visión (FOV) es de 512 x 512 píxeles, lo que significa que con un aumento de periscopio x3, el FOV es de 7,4 x 7,4 mm. Mientras el médico observa el FOV de campo blanco completo, solo analizamos el área de la imagen que contiene los patrones de puntos. Por lo tanto, el tamaño del área analizada es de solo 1,2 x 1,2 mm, que es aproximadamente el diámetro del rayo láser.

La resolución temporal depende de la ecuación:

Mientras que la precisión de la frecuencia depende de la ecuación:

donde N es el número de fotogramas grabados y la velocidad de fotogramas es un parámetro que depende de la cámara. Por lo tanto, el límite de detección del sistema depende de la velocidad de fotogramas de la cámara y del número de fotogramas.

Análisis de información temporal espectral

El análisis se basó en el seguimiento temporal de los patrones de puntos retrorreflejados que se generaron mientras se iluminaba el objeto examinado con un rayo láser.³². Este método permite monitorear vibraciones nanométricas. En la configuración, la frecuencia de vibración se detectó analizando los patrones de motas. Solo la luz reflejada fue recolectada por una lente de imagen rápida y una cámara mientras la mucosa ciliar se iluminaba con láser. Como se mencionó anteriormente, los patrones de motas se recolectaron a través de la óptica en la que el objeto en sí estaba desenfocado, por lo que la cámara enfocó el campo lejano.³³.

En el campo lejano, las vibraciones relacionadas con la inclinación provocan un movimiento lineal, en lugar de cambios en los patrones de motas. Significa que el movimiento de inclinación que genera un cambio de fase lineal dependiente del espacio, se traduce en un movimiento en el plano transversal (el plano X e Y en el campo lejano), proporcional al movimiento de inclinación de la superficie examinada. Por lo tanto, se expresa mediante la transformada de Fourier como una transformación lateral de los patrones de motas. Permite la medición del desplazamiento de objetos mediante el seguimiento del cambio temporal de la correlación máxima^{34, 35}.

Así, el patrón de manchas de cada cuadro fue cambiando debido al movimiento de los cilios. El procesamiento de las imágenes capturadas (Fig. 2) implicó calcular la correlación entre un cuadro dado (\(I_{n}\left({x,y}\right)\)) y el primer cuadro (\(I_{1}\left({x,y}\right)\)) de los patrones de manchas que cambian con el tiempo:

Diagrama de flujo de un algoritmo de procesamiento de imágenes para monitorear la determinación de la frecuencia del movimiento de los cilios.

Por cada dos n fotogramas y el primer fotograma, la ubicación del máximo \ (C_{n}\) Encontrado, denominado \(r_{n}\). El cambio en el sitio de pico de enlace (\(r_{n}\)) justo a tiempo (\(r\izquierda (t\derecha) = \izquierda\{{r_{n}}\derecha\}\)). A medida que el movimiento de los cilios cambia el patrón de manchas observado por la cámara, se produce un cambio en la ubicación del pico de unión. El análisis de dependencia del tiempo de la posición del pico de asociación indica la inclinación de los cilios correspondientes. La frecuencia de movimiento se especifica en el espectro de Fourier.

dónde \(FFT\) Denota la transformada de Fourier. La frecuencia de movimiento de los cilios es el valor máximo en la transformada de Fourier entre 7 y 16 Hz.

El procesamiento de imágenes de puntos de movimiento temporal fue analizado por MATLAB. El flujo de trabajo indica que la información se puede registrar y procesar en un tiempo razonable para generar información sobre los accidentes cerebrovasculares de los cilios. Las transformadas de Fourier no suelen ser computacionalmente intensivas y se pueden realizar en tiempo real.

Para verificar la capacidad del sistema para medir en el rango de frecuencia de 7 a 16 Hz, utilizamos un amplificador de transmisión de frecuencia conocido y lo medimos a través del endoscopio. La cámara tomó fotografías a 200 cuadros por segundo durante 2 segundos, por lo que el número de cuadros fue de 400. Por lo tanto, la resolución de frecuencia fue de ± 0,5 Hz. El espectro de frecuencia medido se presenta como una función de la frecuencia del altavoz (Fig. 3). Se puede ver que hay un fuerte ajuste entre el pico en el espectro medido y el pico transmitido (presentado como una línea diagonal amarilla en la figura).

Calibre el sistema usando el amplificador. Usamos un amplificador para generar vibraciones en el rango de frecuencia de 7 a 16 Hz y medimos el espectro con nuestro sistema. El sistema detectó la frecuencia máxima correcta con una precisión de 0,5 Hz.

Antropometría

Para examinar la cavidad nasal, el médico realiza una nasofaringoscopia (nasofaringoscopia). La nasofaringoscopia es un procedimiento de diagnóstico que examina las estructuras internas de la nariz y la garganta y detecta anomalías en la zona de la nasofaringe. El examen lo realiza un otorrinolaringólogo y suele durar de 2 a 4 minutos. Durante el procedimiento, el paciente se sienta derecho en una silla. Se puede utilizar anestesia local para reducir las molestias durante el procedimiento. En nuestra investigación, un médico insertó almohadillas de algodón humedecidas con una solución de ametocaína al 2% a través de las fosas nasales durante 5 minutos sin usar descongestionantes.

La densidad de células ciliadas aumenta en la cavidad nasal, en dirección postero-posterior y en los senos paranasales.³⁶. Por lo tanto, los registros y mediciones se realizaron a una profundidad de unos 3 cm en la cavidad nasal antes de llegar a la entrada de la nasofaringe. Las mediciones se realizaron en diferentes regiones espaciales de la cavidad nasal: varias regiones de la mucosa ciliar (calibre 22) y la mucosa de la cavidad nasal (calibre 36), de varios sujetos sanos. Los participantes eran hombres jóvenes sanos de entre 20 y 30 años, sin enfermedades subyacentes.

Todos los procedimientos de búsqueda se realizaron con la aprobación del Comité Sheba IRB-Helsinki (Junta de Revisión Institucional para Experimentos con Humanos y Animales). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos que participaron en el ensayo de investigación.